高效液相色谱仪功能

2014-12-05 [2685]

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统,在技术上流动相改为高压输送,色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成从而使柱效大大高于经典液相色谱,同时柱后连有高灵敏度的检测器可对流出物进行连续检测。 
1.进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作,进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。 
2.输液系统该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47~4.4X107Pa,流速可调且稳定,当高压流动相通过层析柱时,可降低样品在柱中的扩散效应,可加快其在柱中的移动速度,这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪,可使流动相随固定相和样品的性质而改变,包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值,或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获得有效分离。 
3.分离系统该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10~50cm(需要两根连用时,可在二者之间加一连接管),内径为2~5mm,由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成,住内装有直径为5~10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成).固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成,它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000?)和比表面积大的特点,加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样),或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此,这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如,在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。 
4.检测系统高效液相色谱仪常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。 
(1)紫外检测器该检测器适用于对紫外光(或可见光)有吸收性能样品的检测。其特点:使用面广(如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);灵敏度高(检测下限为10-10g/ml);线性范围宽;对温度和流速变化不敏感;可检测梯度溶液洗脱的样品。 
(2)示差折光检测器凡具有与流动相折光率不同的样品组分,均可使用示差折光检测器检测。目前,糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单,但灵敏度低(检测下限为10-7g/ml),流动相的变化会引起折光率的变化,因此,它既不适用于痕量分析,也不适用于梯度洗脱样品的检测。 
(3)荧光检测器凡具有荧光的物质,在一定条件下,其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此,这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物(如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等)的测定,其灵敏度很高(检测下限为10-12~10-14g/ml),痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。 
5.数据处理系统该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作,使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。